如何讓利用ImageJ自動計算IHC(免疫組織染色)

此篇利用ImageJ這套軟體來計算IHC，在一個視野下所染的marker數量

ImageJ這套軟體是套老軟體了，介紹的人也很多，在這裡不贅述

一般流程，做完IHC(2 days)，利用顯微鏡或掃片機拍片(1~2 days)
再用肉眼，手握counter一個一個視野計算(時間依視野而定，2~5 days)
實驗流程大約要花兩週時間

使用ImageJ並熟悉使用方式，可以將計算的時間盡量壓縮到一天以內完成
實驗流程能壓縮至5~6天結束

IHC實驗染色為DAB呈色系統，並使用Hematoxylin染細胞核確定細胞位置
此功能ImageJ 原版就有。而我使用的版本Fiji ，算是ImageJ的分支



如要使用此軟體，請要考慮到比例尺的問題

此方法優缺點分析

優點：

1. 極大量節省時間
2. 同一次實驗使用相同條件，比較不會有偏差

缺點：

1. Background太強、hematoxylin太深或結晶沈澱，可能造成誤判
2. 步驟稍微繁瑣（如使用腳本可解決此問題，會再另開文章講解）

Step：

1. 開啟ImageJ，並開啟要分析之圖片
   
2. 拆色（可選RGB stack、HSB stack、Lab stack，或使用8,16,32-bit灰階，如何選擇看需要分析之圖片屬性，個人比較常使用RGB stack的Blue顏色、HSB stack的Saturation或8-bit灰階）
   
3. 拆色完，選擇自己要使用的顏色後，至image=>Threshold...，在這裡可以調整閾值，顏色要多深才是要count的marker。可調整圖中拉桿或直接按Set按鈕直接設定數值。
   
4. 設定完Threshold後視窗不要關閉，直接打開Analyze=>Analyze Particles...，在這裡我們可以設定
   Size（此細胞要在多少pixel^2的範圍內才會計算）
   Circularity（關係到型態，如範圍越靠近1，所算的點形狀越接近圓）
   Show（計算完後在圖片上要如何顯示）
   下面務必勾選Summarize才看得到count的數目喔
   

1. Summary，Count欄位中就是圖中計算的結果啦，還會顯示平均大小與Mean值供您參考
   

總結

這個方法，變數部分為

1. 拆色（RGB stack、HSB stack、Lab stack，8,16,32-bit灰階）
2. 閾值Threshold...（Lower Threshold Level: , Upper Threshold Level:）
3. Analyze Particles...（Size , Circularity）

藉由這些變數，我們可以使用ImageJ中的腳本編輯器來實現自動化載入圖片與計算

請期待下集～